肝臟作為藥物暴露的主要器官，在藥物的代謝和毒性過程中起著至關(guān)重要的作用。原代肝細(xì)胞（Primary Hepatocytes）具有完整的細(xì)胞特性和生理水平的酶和輔助因子，既包括膜結(jié)合酶【如細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶，為滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的還原酶】，也包括胞質(zhì)酯酶，擁有肝臟中所有的代謝途徑。因此，原代肝細(xì)胞（Primary Hepatocytes）被廣泛認(rèn)為是構(gòu)建體外肝臟模型的金標(biāo)準(zhǔn)，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的青睞。因此，本文概述了基于原代肝細(xì)胞的二維（2D）和三維（3D）培養(yǎng)模型及其在藥物研發(fā)中的運(yùn)用。

一、原代肝細(xì)胞分離

大多采用兩步膠原酶灌注法。較小動(dòng)物可通過門靜脈或下腔靜脈進(jìn)行肝臟灌注。較大動(dòng)物通過肝葉或肝節(jié)段灌注。成功分離肝細(xì)胞的幾個(gè)關(guān)鍵因素：第一，無細(xì)胞毒性的膠原酶。第二，恰當(dāng)?shù)南瘯r(shí)機(jī)。消化不足和消化過度都會(huì)損害肝細(xì)胞的產(chǎn)量和活力。第三，良好的肝臟狀況。肝細(xì)胞對缺血性損傷非常敏感。用于制備肝細(xì)胞的肝臟應(yīng)迅速冷卻，以降低代謝速率防止代謝性缺氧和隨后的缺血。分離的原代肝細(xì)胞用于藥物研究的標(biāo)準(zhǔn)：1、實(shí)驗(yàn)開始時(shí)活率> 80%，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中活率下降< 20%；2、對2-3種已知上市藥物的代謝進(jìn)行檢測，與文獻(xiàn)值相當(dāng)；3、誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中典型誘導(dǎo)劑如利福平應(yīng)使特定酶(CYP3A4)活性增加至少3倍；4、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)體研究中，凍存肝細(xì)胞胞接種4-6 h后貼壁率>70%。

二、原代肝細(xì)胞2D培養(yǎng)

懸浮肝細(xì)胞（Suspension Hepatocytes）模型

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擁有完整的藥物代謝酶和輔助因子，可用于不同代謝清除途徑的研究。然而，懸浮肝細(xì)胞(Suspension Hepatocytes)的活率和藥物代謝酶活性隨著體外孵育時(shí)間增加會(huì)逐漸降低，限制其孵育時(shí)間最長為4小時(shí)，一般用于估計(jì)中、高清除速率藥物的清除。當(dāng)清除速率小于20%時(shí)，不能準(zhǔn)確確定清除值。傳統(tǒng)的懸浮肝細(xì)胞體外代謝研究模型不足以使慢代謝化合物產(chǎn)生足夠被檢測到的代謝反應(yīng)，所以在預(yù)測慢代謝化合物的清除率及其代謝產(chǎn)物方面存在局限性。可采用懸浮肝細(xì)胞接力方法（圖1），孵育時(shí)間可延長至20小時(shí)甚至更長。

應(yīng)用：小分子藥的酶活性和代謝穩(wěn)定性研究。

圖1. 懸浮肝細(xì)胞接力法轉(zhuǎn)移流程DRUG METAB DISPOS, 2012,40(9):1860–1865

貼壁肝細(xì)胞（Plateable Hepatocytes）模型

原代肝細(xì)胞2D培養(yǎng)于膠原蛋白包被的培養(yǎng)物表面。肝細(xì)胞呈現(xiàn)上皮形態(tài)，細(xì)胞核突出，常呈雙核狀。單一肝細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的缺陷：1、細(xì)胞極性和功能發(fā)生改變；2、缺乏正常功能所需的其它相關(guān)細(xì)胞類型(即非實(shí)質(zhì)細(xì)胞)；3、無法提供足夠的營養(yǎng)和旁分泌因子以支持肝細(xì)胞執(zhí)行功能(如膽汁酸和血清蛋白的生物合成)。

應(yīng)用：

★評價(jià)藥物-藥物相互作用:包括酶誘導(dǎo)、酶抑制和轉(zhuǎn)運(yùn)體研究。首先，當(dāng)藥物作為誘導(dǎo)劑時(shí)，可導(dǎo)致藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)增加。強(qiáng)效誘導(dǎo)劑可同時(shí)上調(diào)多個(gè)基因，如苯-巴比-妥誘導(dǎo)CYP2B6、CYP3A4、CYP2C9、UGT以及MRP2等多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其次，不同種屬肝細(xì)胞對誘導(dǎo)劑反應(yīng)存在差異。如利福平對人和兔肝細(xì)胞是一種有效的誘導(dǎo)劑，但對大鼠肝細(xì)胞無誘導(dǎo)作用。最后，貼壁肝細(xì)胞（Plateable Hepatocytes）亞理想的鋪板密度可能導(dǎo)致P450的基礎(chǔ)表達(dá)降低，并人為增加誘導(dǎo)反應(yīng)，如圖3所示，貼壁肝細(xì)胞在較小鋪板密度時(shí)CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4的基礎(chǔ)活性都較低，卻有更強(qiáng)的誘導(dǎo)反應(yīng)。因此需要健康、合適鋪板密度的肝細(xì)胞來獲得生理學(xué)相關(guān)的數(shù)據(jù)。

圖2.凍存人肝細(xì)胞鋪板密度與酶誘導(dǎo)的關(guān)系Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7:188-198

★肝毒性評估：光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、液泡和脂滴的聚集以及細(xì)胞的附著/脫落等形態(tài)學(xué)變化。檢測肝細(xì)胞壞死（谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶) 和凋亡（DNA斷裂）。對于細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，由于受鄰近的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞如Kupffer、星狀和竇狀內(nèi)皮細(xì)胞釋放的物質(zhì)調(diào)控，單一貼壁培養(yǎng)的肝細(xì)胞不能預(yù)測毒性反應(yīng)。

★ "接力法"用于慢代謝化合物清除率及其代謝產(chǎn)物研究: 貼壁肝細(xì)胞藥物代謝酶活性在貼壁培養(yǎng)24 h 后開始降低?？蓪①N壁肝細(xì)胞用含待測化合物的無血清培養(yǎng)基孵育24小時(shí)后，收集培養(yǎng)基混合后置于新貼壁培養(yǎng)的肝細(xì)胞（圖3）。

圖3. 貼壁肝細(xì)胞接力法轉(zhuǎn)移流程Drug Metabolism Letters, 2016,10: 3-15

★評估靶向肝細(xì)胞的小核酸藥的細(xì)胞攝取、內(nèi)吞、內(nèi)體逃逸以及對靶基因的沉默效果。

三明治培養(yǎng)模型

在體外通過在兩層膠原或Matrigel內(nèi)培養(yǎng)肝細(xì)胞可以重構(gòu)體內(nèi)結(jié)構(gòu)，稱為三明治培養(yǎng)。肝細(xì)胞培養(yǎng)在兩層凝膠-膠原之間(夾心結(jié)構(gòu))，可改善肝細(xì)胞的形態(tài)和活力，并在培養(yǎng)中維持較長時(shí)間的功能。此外，三明治式培養(yǎng)的肝細(xì)胞可重新恢復(fù)極性，允許基底外側(cè)和小管轉(zhuǎn)運(yùn)體

的適當(dāng)定位以及功能性膽管網(wǎng)絡(luò)的形成（圖4）。

圖4.人肝細(xì)胞三明治模型中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的極化表達(dá)Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7, 188-198

應(yīng)用：

★估計(jì)化合物的膽道排泄。

★評估內(nèi)源性和外源性化合物和代謝物的肝膽分布。

★估計(jì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的清除，構(gòu)建基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)模型。

★研究肝細(xì)胞毒性，提供臨床藥物性肝損傷的機(jī)制。數(shù)據(jù)整合到系統(tǒng)藥理學(xué)模型中預(yù)測人類潛在的藥物性肝損傷。

三、原代肝細(xì)胞3D培養(yǎng)

球狀體（Spheroid）模型

通過超低粘附培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng)、磁化細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)（圖5），原代肝細(xì)胞可不依賴外部基質(zhì)，聚集形成直徑高達(dá)150-175µm的球狀團(tuán)聚體。球狀體培養(yǎng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，每個(gè)球體只需要1330-2000個(gè)細(xì)胞，與其它3D培養(yǎng)技術(shù)相比顯著減少。最近的一項(xiàng)研究表明原代肝細(xì)胞球狀體培養(yǎng)可持續(xù)5周，CYP酶活性在第8天到第35天之間幾乎沒有變化。一項(xiàng)蛋白質(zhì)組分析表明，與三明治培養(yǎng)相比，球形培養(yǎng)中負(fù)責(zé)藥物吸收、分布、代謝和排泄的酶能更好地保存14天。然而，肝臟比細(xì)胞團(tuán)復(fù)雜得多。肝細(xì)胞的基底外側(cè)與血液接觸，在頂端側(cè)膽汁流出，這是復(fù)雜的肝小葉結(jié)構(gòu)的主要特征，目前還不能在球狀體模型中復(fù)制。

應(yīng)用：

★慢代謝化合物清除率及其代謝產(chǎn)物研究。

★肝細(xì)胞毒性研究。

★評估靶向肝細(xì)胞的小核酸藥的細(xì)胞攝取、內(nèi)吞、內(nèi)體逃逸以及對靶基因的沉默效果。

圖5.球狀體培養(yǎng)方法

肝類器官（Liver Organoids）模型

對類器官定義的共識是:來源于干細(xì)胞、祖細(xì)胞或分化細(xì)胞的3D結(jié)構(gòu)，能夠在體外再現(xiàn)原生組織的某些功能和結(jié)構(gòu)，可有效地再現(xiàn)體內(nèi)微環(huán)境和細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。肝類器官已被確定為人類肝臟生物學(xué)研究的最-先進(jìn)模型。

構(gòu)建肝類器官的細(xì)胞來源：

多能干細(xì)胞(PSCs)：胚胎干細(xì)胞(ESCs)和誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPSCs)具有高多能性、可塑性和無限增殖能力，在特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的作用下分化為具有活性和功能的肝細(xì)胞樣細(xì)胞。然而，PSCs誘導(dǎo)的肝類器官可能發(fā)生表觀遺傳和遺傳畸變，在擴(kuò)增過程中表現(xiàn)出染色體非整倍體改變。

應(yīng)用：

★構(gòu)建遺傳性肝病模型

★構(gòu)建感染性肝病模型

★藥物細(xì)胞毒性

★移植和肝臟疾病研究。

肝組織來源細(xì)胞：包括膽管細(xì)胞和肝細(xì)胞。成熟肝細(xì)胞在特定環(huán)境中仍具有干細(xì)胞潛能和增殖能力。與PSCs誘導(dǎo)的類器官相比，原代組織來源的類器官更成熟，基因組更穩(wěn)定，在長期體外培養(yǎng)過程中保持了表型和遺傳穩(wěn)定性。然而，與胎兒人肝細(xì)胞或成年小鼠原代肝細(xì)胞相比，成熟人肝細(xì)胞類器官的長期增殖能力有限。到目前為止，成人肝細(xì)胞類器官的培養(yǎng)仍然具有挑戰(zhàn)性。

培養(yǎng)方法（圖6）：肝組織消化成單細(xì)胞，將Matrigel/細(xì)胞混合物接種在24孔板中，以形成圓頂狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃)中孵育15分鐘。凝固后加入特定培養(yǎng)基。大約14天后傳代。7-10天后，用分化培養(yǎng)基替換原來的培養(yǎng)基。

應(yīng)用：

★肝毒性模型

★體外代謝紊亂研究。

★非酒精性脂肪肝疾病

★良性和惡性肝病的藥物開發(fā)

圖6. 組織源性肝類器官的培養(yǎng)和傳代過程Cell & Bioscience (2023) 13:197

球狀體培養(yǎng)與類器官培養(yǎng)比較

四、原代肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型

2D原代肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型

將兩種或兩種以上不同類型的細(xì)胞混合在2D培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)。其關(guān)鍵特征在于不同細(xì)胞之間的直接相互作用，細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，或者通過細(xì)胞因子、化學(xué)通訊間接傳遞信號。原代肝細(xì)胞功能（如白蛋白產(chǎn)生和藥物代謝能力）可以維持長達(dá)3周。

★原代肝細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)：用于慢代謝化合物清除率及其代謝產(chǎn)物研究。

★原代肝細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞（星狀細(xì)胞，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞）共培養(yǎng)：用于藥物性肝損傷的研究，有助于研究細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子在藥物暴露后調(diào)節(jié)肝臟適應(yīng)性反應(yīng)中的作用。

★原代肝細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)：檢測肝藥物代謝特異性T細(xì)胞反應(yīng)。

★IPHASE也開發(fā)了不同種屬的原代肝細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)HepatoMaxTM（圖7），通過原代肝細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，可以實(shí)現(xiàn)人原代肝細(xì)胞在3周內(nèi)保持良好的藥物代謝酶活性，適用于慢代謝化合物清除率及其代謝產(chǎn)物研究。

圖7. IPHASE人原代肝細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)

3D原代肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型

直接3D共培養(yǎng)：將兩種或多種不同類型的肝細(xì)胞（原代肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞）混合成自組裝球體，或在膠原蛋白、纖維蛋白、海藻酸鹽和水凝膠等構(gòu)建的3D環(huán)境中共同培養(yǎng)。直接3D共培養(yǎng)可以使不同肝細(xì)胞緊密接觸，通過細(xì)胞間直接黏附、可溶性細(xì)胞因子旁分泌、細(xì)胞外基質(zhì)黏附等機(jī)制實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞間的信號通信。

應(yīng)用：

★構(gòu)建肝纖維化模型

★構(gòu)建藥物性肝損傷模型

★評估藥物相互作用、藥物代謝和酶誘導(dǎo)。

間接三維共培養(yǎng)：采用物理分離系統(tǒng)（Transwell或各種材料）將兩種或兩種以上類型的細(xì)胞（如原代肝細(xì)胞與NIH/3T3細(xì)胞或肝竇內(nèi)皮細(xì)胞）在3D環(huán)境中分層培養(yǎng)，物理分離系統(tǒng)兩側(cè)的細(xì)胞之間不允許直接接觸，它們之間的信號通過可溶性細(xì)胞因子進(jìn)行溝通。

應(yīng)用：研究非接觸式肝細(xì)胞在體通信。

綜上所述，IPHASE作為體外研究生物試引-領(lǐng)者，為助力藥物體外非臨床研究，從多種屬原代肝細(xì)胞的分離、培養(yǎng)，到相應(yīng)輔助產(chǎn)品如不同應(yīng)用場景下的配套培養(yǎng)基或不同需求下的多規(guī)格膠原包被板；從提供產(chǎn)品到提供原代肝細(xì)胞的分離、培養(yǎng)服務(wù)，IPHASE始終如一，致力于為客戶提供最-好的藥物體外非臨床研究“武-器"，是廣大客戶優(yōu)選的合作伙伴！

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